上海遠慕為您講述：大鼠乳鼠成骨細胞培養

大鼠乳鼠成骨細胞培養培養可以：（1）獲得大鼠乳鼠成骨細胞；（2）用于骨修復的細胞學機制研究。

實驗方法：

酶消化法

實驗方法原理取材于出生2~3d小鼠顱骨，以含20%胎牛血清的DMEM培養液進行培養，采用膠原酶消化法分離成骨細胞，并進行細胞接種與傳代。采用膠原酶消化法分離培養成骨細胞是一種可靠、簡便、快速的細胞原代分離培養方法。

實驗材料：

SD大鼠

試劑、試劑盒

F12*培養液胰蛋白酶Ⅱ型膠原酶酒精

儀器、耗材

手術器械磁力攪拌器

實驗步驟

一、實驗步驟

1.拉頸處死24小時內新生的SD大鼠，75%乙醇浸泡5min，取出頭蓋骨，分離頂骨和額骨，冰生理鹽水液反復洗滌大鼠乳鼠顱蓋骨標本除去脂肪組織及殘留血，放入另一盛有F12*培基液的培養皿中再洗滌，將顱骨剪成2～5mm2碎片，將洗滌過的骨碎片用0.25%胰蛋白酶2ml預消化15min，以清除纖維組織細胞，棄去上清液(其中主要含成纖維細胞)。

2.然后以0.1%Ⅱ型膠原酶10ml，在37℃環境中消化20分鐘，室溫下磁力攪拌消化20分鐘。靜置數分鐘，收集消化液，室溫下以1200rpm離心10分鐘。去除上清液，用20%胎牛血清的F12培養液4ml懸浮細胞，接種于75ml培養瓶中，補培養液8ml使每瓶液體量達到12ml；對靜置后沉淀部分可再重復以膠原酶消化20分鐘、磁力攪拌消化15分鐘、離心10分鐘，將獲得的3瓶細胞放置于二氧化碳培養箱，在5%CO2，95%空氣，37℃溫度下培養，24小時后可見細胞貼壁生長，胞質開始伸展，換新鮮培養液，以后每隔48小時換培養液(注：消化視具體情況而定，也可多消化1遍)。

3.原代培養一般接種后第7天能長滿。傳代時，取生長良好、貼壁松緊適度的成骨細胞1瓶，棄去培養液，傳代時先以PBS沖洗2遍，加0.25%胰酶1ml，室溫下消化3～5分鐘，將胰蛋白酶液棄去，加F12培養液充分吹打8-10分鐘。將已消化的細胞收集、合并，計數；用F12*培基調節至細胞濃度為合適濃度。一般取2-5代成骨細胞進行實驗。代數太多，細胞老化或者分化明顯。

二、結果

如圖所示，成骨細胞的形狀和成纖維細胞非常相似，但是不同的是，比成纖維細胞更不容易消化，尤其是傳代次數多，細胞老化的時候，非常難消化，并且不易消化成單個細胞。

三、鑒定的方法

1.堿性磷酸酶(ALP)活性檢測

2.骨玻璃樣蛋白(BGP)檢測

3.礦化結節檢測

其他

一、討論

成骨細胞包繞在硬組織中，致使處理困難，可采用骨組織塊法、酶消化法、骨膜組織塊法、骨髓培養法以及薄層骨片經EDTA處理并經膠原酶消化，均可培養出成骨細胞。體外培養的成骨細胞保持有骨組織細胞的某些特征。據文獻報道，不同方法培養的成骨細胞形態是不同的[1]。