抗生素殘留檢查法（培養法）實驗步驟

本法系依據在瓊脂培養基內抗生素對微生物的抑制作用，比較對照品與供試品對接種的試驗菌產生的抑菌圈的大小，檢查供試品中氨芐西林或四環素殘留量。

磷酸鹽緩沖液（pH6.0）的制備  稱取磷酸二氫鉀8.0g、磷酸氫二鉀2.0g，加水溶解并稀釋至1000ml，經121℃滅菌30分鐘。

抗生素Ⅱ號培養基的制備  稱取胨6g、牛肉提取粉1.5g、酵母浸出粉6g，加入適量水溶解后，加入瓊脂13～14g，加熱使之溶脹，濾過除去不溶物，加入葡萄糖1g，溶解后加水至1000ml，調pH值使滅菌后為6.5～6.6；分裝于玻璃管或錐形瓶中，經115℃滅菌30分鐘，4℃保存。

對照品溶液的制備  取氨芐西林對照品適量，用0.01mol/L鹽酸溶解并稀釋成每1ml中含氨芐西林10mg的溶液，精密量取適量，用磷酸鹽緩沖液稀釋成每1ml中含1.0μg的溶液。

取四環素對照品適量，用生理氯化鈉溶液溶解并稀釋成每1ml中含0.125μg的溶液。

菌懸液的制備  （1）金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）懸液   用于檢測氨芐西林。取金黃色葡萄球菌（CMCC 26003）營養瓊脂斜面培養物，接種于營養瓊脂斜面上，35～37℃培養20～22小時。臨時用，滅菌水或0.9%無菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。

（2）藤黃微球菌（Microccus luteus）懸液    用于檢測四環素。取藤黃微球菌[CMCC （B）28001]營養瓊脂斜面培養物，接種于營養瓊脂斜面上，置26～27℃培養24小時。臨用時，用0.9%無菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。

檢查法   取直徑8cm或10cm的培養皿，注入融化的抗生素Ⅱ號培養基15～20ml，使在碟底內均勻攤布，放置水平臺上使凝固，作為底層。取抗生素Ⅱ號培養基10～15ml置于50℃水浴預熱的試管中，加入0.5%～1.5%（ml/ml）的菌懸液300μl混勻，取適量注入已鋪制底層的培養皿中，放置水平臺上，冷卻后，在每個培養皿上等距離均勻放置鋼管（內徑6～8mm、壁厚1～2mm、管高10～15mm的不銹鋼管，表面應光滑平整），于鋼管中依次滴加供試品溶液、陰性對照溶液（磷酸鹽緩沖液）及對照品溶液。培養皿置37℃培養18～22小時。

結果判定  對照品溶液由抑菌圈，陰性對照溶液無抑菌圈。供試品溶液抑菌圈的直徑小于對照品溶液抑菌圈的直徑時判為陰性；否則判為陽性。

【附注】本試驗應在無菌條件下進行，使用的玻璃儀器、鋼管等應無菌。