凝膠層析（凝膠過濾法）基本原理

凝膠層析也稱凝膠過濾法，是20 世紀60 年代發展起來的一種簡便有 效的 生物 化學分離分析方法。這種方法的基本原理是用一般的柱層析方法使 相對分子質量不同的溶質通過具有分子篩性質的固定相（凝膠），從而使物 質分離。

用作凝膠的材料有多種，如交聯葡聚糖、 瓊脂糖、聚丙烯-酰胺凝膠、聚 苯乙-烯和多孔玻璃珠等?，F以利用交聯葡聚糖分離物質和測定相對分子質量 為例說明凝膠層析法的基本原理和應用。

交聯葡聚糖（商品名Sephadex）是由細菌葡聚糖（以右旋葡萄糖為殘基 的多糖）用交聯劑環氧氯丙-烷交聯形式的有三維空間的網狀結構物?？刂破?聚糖和交聯劑的配比及反應條件就可決定其交聯度的大?。ń宦摱却?，“網 眼”就?。?，從而得到各種規格的交聯葡聚糖，即不同型號的凝膠。“G”表 示交聯度，G 越小，交聯度越大，吸水量也就越小。

把經過充分溶脹凝膠裝入層析柱中，在加入樣品以后，由于交聯葡聚糖 的三維空間網狀結構，小分子能夠進入凝膠，較大的分子則被排阻在交聯網 狀物之外，因此各組分在層析床中移動的速度因分子的大小而不同。相對分 子質量（Mr）大的物質只是沿著凝膠顆粒間的孔隙隨溶劑流動，其流程短， 移動速度快，先流出層析床。相對分子質量小的物質可以透入凝膠顆粒，流 程長，移動速度慢，比相對分子質量大的物質遲流出層析柱。經過分部收集 流出液，相對分子質量（Mr）不同的物質便互相分離。SpladexG-10 到G -50 通常用于分離肽或脫鹽。G-10 到G-50 通常用于分離肽或脫鹽。G-75 到 G-200 可用于分離相對分子質量大于10000 的蛋白質。

交聯葡聚糖分子含有大量的羥基，極性很強，易吸水，所以使用前必須 用水充分溶脹。1g 干重凝膠充分溶脹時所需的水量（mL）稱為凝膠的得水 值（Wr）。因為得水值不易測定，故常用溶脹度即床體積來表示凝膠的得水 性，其定義是每克干重凝膠顆粒在水中充分溶脹后所具有的凝膠總體積。 2、凝膠柱的總體積（總床體積）Vt 是干膠體積Vg，在凝膠顆粒內部的 水的體積Vi 及凝膠顆粒外部的水的體積Vo 之和。

Vt 也可從柱的直徑及高度計算。

Vo 也稱外水體積。常常用洗脫一個已知*被排阻的物質（如藍葡聚糖 2000）的方法來測定，此時其洗脫體積就等于Vo。

Vi 稱為內部體積或內水體積，可以從凝膠干重（mg）和得水值Wr 計算： Vi = mg. Wr

Vi 也可以從洗脫一個小于凝膠工作范圍下限的小分子化合物，如鉻-酸鉀 來測定，其洗脫體積等于Vi+Vo。

某一物質的洗脫體積Ve 為：Ve=Vo + KdVi

Kd 為溶質在流動相和固定相之間的分配比例（分配系數），每一溶質都 有特定的Kd 值，它與層析柱的幾何形狀無關。

如果分子*被排阻，則Kd=0，Ve=Vo。如果分子可以*進入凝膠，那 么Kd=1，Ve=Vo+Vi。在通常的工作范圍內Kd 是一個常數（0

溶質的洗脫特征的有關參數（Ve/Vo，Ve/Vt，Kd，Kav）都與溶質相對分 子質量（Mr）對數成線性關系，先洗脫幾個已知相對分子質量（Mr）的球 蛋白，用Ve/Vo 對logMr 對作圖，然后在同樣條件下洗脫未知樣品，從其 Ve/Vo 值，在圖上即可找出相對應的logMr，從而進一步算出其相對分子質 量（Mr）。

不同規格的凝膠都有一定的工作范圍。一般說，在工作范圍之內所得的 曲線是線性的，超出工作范圍曲線就不成線性。