凝膠色譜使用的注意事項

凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜法主要用于高聚物的相對分子質量分級分析以及相對分子質量分布測試。根據分離的對象是水溶性的化合物還是有機溶劑可溶物，又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。

凝膠色譜法分類

根據分離的對象是水溶性的化合物還是有機溶劑可溶物，又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。

凝膠過濾色譜：

凝膠過濾色譜一般用于分離水溶性的大分子，如多糖類化合物。凝膠的代表是葡萄糖系列，洗脫溶劑主要是水。

凝膠滲透色譜：

凝膠滲透色譜法主要用于有機溶劑中可溶的高聚物(聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相對分子質量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為四氫呋喃等有機溶劑。

凝膠色譜不但可以用于分離測定高聚物的相對分子質量和相對分子質量分布，同時根據所用凝膠填料不同，可分離油溶性和水溶性物質，分離相對分子質量的范圍從幾百萬到100以下。

近年來，凝膠色譜也廣泛用于分離小分子化合物?；瘜W結構不同但相對分子質量相近的物質，不可能通過凝膠色譜法達到*的分離純化的目的。

凝膠色譜法原理

凝膠色譜法又稱體積排阻色譜法，使用水溶液流動相的稱為凝膠過濾色譜，使用有機溶劑流動相的稱為凝膠滲透色譜。凝膠色譜的固定相是多孔物質，如多孔凝膠、交聯聚苯乙烯、多孔玻璃及多孔硅膠等。試樣是按照其中各組分分子大小的不同而分離的。大于填料微孔的分子，由于不能進入填料微孔，而直接通過柱子，Z先流出柱外，在色譜圖上Z早出現，小于填料微孔的組分分子，可以滲透到微孔中不同的深度，相對分子質量Z小的組分，保留時間Z長。

凝膠色譜與凝膠層析是否一樣？

基本上是一致的只是固定相存在差異。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜主要用于高聚物的相對分子質量分級分析以及相對分子質量分布測試。

凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析，操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，并且對分離成分理化性質的保持有獨到之處。

兩者的共同點是都不需要有機溶劑。凝膠色譜色譜一般用在HPLC等分析場合。而凝膠層析一般用在制備的時候。

凝膠凈化柱和凝膠色譜柱是一回事嗎?

原理是一回事，都是排阻色譜。 但是前者是制備柱，對大量樣品進行分離，柱子口徑大，一般要有切割承樣的尾接裝置；后者是分析柱，主要目的是對小量樣品進行分析，柱子直徑小，一般還有柱溫箱，對泵的穩定性要求高，必須接檢測器。

凝膠種類及性質

1、Sephadex G

交聯葡聚糖的商品名為Sephadex，不同規格型號的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯數為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克，同樣G-200克每克干膠吸水20克。交聯葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G"反映，凝膠的交聯程度，膨脹程度及分部范圍。

2、Sephadex LH-20

Sephadex LH-20是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質。交聯葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質，防止微生物的生長，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有：

（1）疊氨鈉（NaN3）

在凝膠層析中只要用0.02%疊氮鈉已足夠防止微生物的生長，疊氮鈉易溶一水，在20℃時約為40%；它不與蛋白質或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會改變蛋白質和碳水化合物的層析我特性。疊氮鈉可干擾熒光標記蛋白質。

（2）可樂酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]

在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的殺菌效果Z佳，在強堿性溶液中或溫度高于60℃時易引起分解而失效。

（3）乙基汞代巰基水楊酸鈉

在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0. 01%。在微酸性溶液中Z為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質結合，因而包含疏基的蛋白質可在不同程度上降低它的抑菌效果。

（4）苯基汞代鹽

在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01%。在微堿性溶液中抑效果Z佳，長時間放置時可與鹵素、硝酸根離子作用而產生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質亦可降低或抑制它的抑菌作用。

使用凝膠色譜儀的注意事項

溶劑準備：使用HPLC純溶劑，如有必要，進行過濾。保證溶劑的相溶性，避免使用對不銹鋼有腐蝕性的溶劑。

溶劑脫氣：超聲脫氣。

樣品準備：過濾樣品，確保樣品中不含固體顆粒，用流動相溶解樣品。

色譜柱的保護

1、防止氣體進入色譜柱。凝膠柱是不允許氣泡進入的，否則將會使柱效降低甚至形成微小的難以驅除的氣室。因此，為了防止氣泡進入色譜柱，一定要使用經過脫氣的流動相，并且要嚴格按照下列步驟來安裝色譜柱。

a.拆卸下色譜柱入口處的密封螺絲，觀察是否有溶劑滲出；

b.如有溶劑滲出，即可將色譜柱接到管路上，以避免氣泡的進入；

c.如無溶劑滲出時，表明色譜柱的此端已經進去空氣了，此時，可將色譜柱的出口端接到進樣閥上，以流動相來反方向沖洗色譜柱，以便將柱內的空氣排除。最好以0.2ml/min的小流量來沖色譜柱，如果溶劑的流速太快或者是壓力突然的上升都將會導致柱性能的降低；

d.如果流出的溶劑里不含有氣泡，說明柱內的氣體已經被排出了，再將色譜柱以正確的方向接好，這樣氣泡就進不到色譜柱里面了。

2、色譜柱的清洗

為了不使被測物質和雜質停留在色譜柱中，在每次的樣品分析工作完成之后，都應及時地清洗色譜柱。首先要用對被測樣品洗脫能力強的溶劑來洗脫色譜柱，以分析工作中常用的反相色譜分析法為例，因其先流出的物質是極性大的物質，此時應用100%的甲醇或使用異丙純、四氫呋喃等極性稍弱的溶劑將吸附在柱內的極性小的物質洗脫下來，洗脫液的用量一般為柱體積的20倍即可。如果流動相是緩沖溶液，則應先用蒸餾水來沖洗色譜柱，以沖掉柱內的鹽，然后再用合適的溶劑來沖洗。

凝膠濾過色譜法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝膠柱常用緩沖溶液做流動相，用完之后當然要用蒸餾水來沖洗。如果是連續操作，可以將緩沖溶液置于柱內過夜，但最好是維持小流速(＜0.5ml/min)以防止緩沖鹽的析出，如果流動相中含有鹵化物，即使是停一夜，也必須要用蒸餾水將色譜柱沖洗干凈，以防止它們對柱體的腐蝕。

3、色譜柱的存放

如果色譜柱暫時不用，存放時要注意以下幾點：

a.幾天之內的短期放置，凝膠柱則用蒸餾水來沖洗，再把色譜柱的兩頭用密封螺絲密封好即可。

b.如果色譜柱長期不用，僅用上述方法來處理就不行了，這時應使用色譜柱使用說明書中所指明的溶劑來充滿色譜柱，凝膠柱則不能用水了，因柱內如果有微生物的生長則會使柱效降低，此時應用0.05%的NaNs水溶液(防腐劑)來沖洗色譜柱，再將色譜柱封嚴。色譜柱長期放置時，一定要將色譜柱的兩端封嚴，以防止由于溶劑揮發而造成的柱填料干縮現象，因這可導致柱效的嚴重降低。

c.色譜柱應貯存在室溫下，如果放置于0℃以下的環境里，柱內就會結冰，這也將導致柱效的降低。

4、不要高溫使用

5、不要高壓沖洗柱子

6、對儀器的維護和保養進行記錄