KO細胞中目的蛋白殘留問題及解決方案

在我們鑒定基因敲除（KO）細胞是否建立成功時，除了基因水平的測序、PCR等方法外，蛋白水平的Western Blot驗證也是一個重要的方法。特別是對于文章發表中結果的呈現，Western Blot圖尤為重要。但在實際實驗的過程中，偶爾也會出現測序鑒定為KO純合子但WB實驗卻有條帶的情況，即蛋白殘留。那么基因敲除細胞時蛋白殘留是如何產生的呢？
 
1 由于目的基因的多轉錄本引起的蛋白殘留
基因一般含有多個不同的轉錄本，在選擇敲除位點時，有時會很難保證覆蓋所有的轉錄本，而未被影響到的轉錄本就有可能正常轉錄翻譯從而表達出具有部分功能域的蛋白。因此，我們在設計KO細胞方案時，應綜合考慮數據庫基因信息、文獻，甚至通過預實驗，從而盡可能地覆蓋多個轉錄本，當然，這就對方案設計的人員有較高的技術和經驗要求。
 
2 由于基因的可變剪切引起的蛋白殘留
可變剪切指當某個外顯子被破壞或缺失時，其轉錄的mRNA前體通過不同的剪接方式產生不同的mRNA剪接異構體的過程，是調節基因表達和產生蛋白質多樣性的重要機制。當我們構建KO細胞時，敲除位點處外顯子被切割后，包含在內含子中的RNA剪接規則同時被破壞，在一定情況下，缺失的外顯子序列在RNA剪切階段被略過，直接將其上游的外顯子與下游的外顯子相連，形成一種全新的mRNA，從而繼續蛋白的翻譯。
 

 
可變剪切發生機制

 
3 外因——Western Blot抗體的選擇
Western Blot檢測技術是基于抗原抗體的特異性結合的原理，且抗體并不是識別整個目的蛋白，而是識別某段特定氨基酸序列或其中某部分功能結構域，即抗體的特異性。因此，在采用Western Blot檢測KO細胞是否存在蛋白殘留表達時，如果選擇的敲除位點相對靠后，而抗體與蛋白的結合區域若存在于敲除位點之前，便可能會出現抗體與N端殘留蛋白的結合，從而導致Western Blot檢測條帶的出現。不過對于這種情況，目的蛋白的功能很可能已經喪失。
 
我們該如何規避蛋白殘留風險？
 
首先，也是最重要的，就是gRNA的設計！gRNA的設計決定了切割位點的位置，因此gRNA的設計通常也是避免蛋白殘留問題的關鍵。特別對于移碼突變的敲除策略，gRNA的設計更為重要，一般建議設計3條gRNA，并在cell pool階段根據切割效率的高低來選擇。
 
有gRNA設計經驗的同學對那幾個常用的gRNA設計網站應該比較熟悉，但網站設計的結果只是一個參考，我們不僅需要綜合多個數據庫的設計結果、也要結合相關的文獻報道，同時參考常用抗體信息的分析，并根據實際情況進行階段性的WB測試，從而實現所建立的KO細胞無蛋白殘留。
 
另外，對于長度較短、又無法找到合適切割位點的基因，我們也可采取大片段敲除或全敲的策略，確保得到的純合子細胞蛋白不殘留。