影響革蘭氏染色結果準確性的關鍵因素

革蘭氏染色是大家檢測過程中常用到的基本技能之一，也是輔助我們鑒別菌種種類的基礎方法之一。但大家在日常的革蘭氏染色過程中有沒有發現過這樣的問題：明明是革蘭氏陰性菌，怎么我的染色結果是陽性呢？或者怎么陽性菌被我染成陰性了呢？為什么會產生這樣的偏差？

革蘭氏染色是一項經典的細菌鑒別手段，自19世紀80年代丹麥的醫師GRAM創立起，至今已經近一個半世紀，仍舊在細菌的檢測和鑒定分類上被廣泛應用著。在我國，GB 4789系列的國標中很多致病菌的檢測也都需要進行革蘭氏染色，可見其重要性。甚至可以說沒有精準掌握革蘭氏染色的微生物檢驗員，不會是一個合格的檢驗員。

革蘭氏染色的原理：

細菌細胞通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現縫隙，因此能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

革蘭氏染色的步驟：

涂片、晾干、固定、染色、水洗、媒染、脫色、復染。此處不加贅述。

影響革蘭氏染色結果準確性的關鍵因素：

1.試劑影響。這是我們首先應該確保的，我們使用的試劑必須是有效的。實驗室應當建立有效的試劑管理程序，從試劑的驗收到存放、使用、過期后的廢棄處理都應有嚴格規定，確保我們使用的試劑是有效的。工欲善其事必先利其器，這也是我們試驗成功最基礎的一環。

2.染色菌的選擇。菌齡對革蘭氏染色結果的影響是十分大的。我們染色過程中選擇的菌應該是處于活躍生長期，這樣的細菌活性強，生理特征明顯，所以染色的結果準確度高，一般情況下不會出現誤差。培養時間較長的革蘭氏陽性菌，由于細胞老化，甚至有部分菌在染色之前就已經死亡或者自行溶解了，造成細胞壁通透性增加，就會呈現出假陰性。以金黃se葡萄球菌為例，金葡是典型的革蘭氏陽性菌，有人曾經統計過培養至不同時間的金葡的革蘭氏染色結果，結果表明，在金葡活躍期的22h-26h之間，染色結果的準確率基本可以達到100%，而超過26h之后，準確率就開始下降，培養至36h時，準確率大概會下降30%左右。所以我們在染色時，一定要選擇處于活躍期、活性較強的菌落，在檢測過程中一定要嚴格的在國標要求的時間段內進行染色試驗，不能提前或者延后。

3.涂菌的狀態。在染色最初的涂布中，在挑取菌體后應該在無菌水上涂成薄薄的菌膜。而在涂布過程中，若是菌體堆積，也會極大影響染色結果的準確性。菌落堆積過多，往往菌體之間變得毫無縫隙，而其細胞壁的成分影響造成了脫色的情況不佳，容易產生假陽性的結果。同時，在初染、媒染及復染的過程中，應將染液覆蓋整個菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌沒有染色。因此在涂片過程一定要將菌膜涂得少而均勻，這樣才能達到最佳效果。

4.媒染時間。媒染時間對革蘭氏陰性菌的染色結果有很大影響。由于媒染時間過長，結晶紫在碘液長時間作用下過分牢固結合在菌體細胞壁上，影響了酒精的脫色效果，從而會導致這種假陽性的效果。以典型的革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌為例，有人做過統計，媒染時間嚴格控制在40s-60s之內，染色結果準確率基本可達到100%，而超過60s準確率會有一定的降低，若媒染超過100s，準確率甚至可降低接近20%左右。因此在媒染過程中一定要注意媒染時間，控制在50-60s為宜。

5.酒精脫色。酒精脫色也是一個對結果影響較大的操作過程。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌最主要的差異是細胞壁肽聚糖層厚度和結構，革蘭氏陰性菌細胞壁肽聚糖層很薄，脂多糖含量高因此在酒精脫色時，細菌細胞壁的多糖成分會被酒精溶解，增大了細胞壁的通透性，結晶紫及碘復合物就很快被酒精洗脫，之后就會被沙黃復染呈紅色；而陽性菌肽聚糖層厚，脂多糖少，酒精只能起到脫水效果而無法進入，這樣結晶紫和復合物就無法洗脫出來使細胞呈紫色。因此，酒精脫色時間短，脫色效果不佳，會導致陰性菌菌體內的結晶紫和復合物不能有效的全部洗脫出來，就會出現明顯的誤差，使陰性菌出現假陽性。而洗脫時間過長，也會導致陽性菌的細胞壁被酒精破壞，導致細胞內的紫色被洗脫，呈現假陰性。因此洗脫時間也是革蘭氏染色的關鍵環節。洗脫時間應當嚴格控制在20s-30s之間，同時保證洗脫效果。

總結一下，在整個革蘭氏染色過程中，在保證試劑有效的前提下，需要嚴格控制的幾個方面：染色菌必須是在其活躍期內，涂布狀態不可太厚，媒染時間嚴格控制在50s-60s之間，脫色時間嚴格控制在20s-30s。把握以上的關鍵控制點，革蘭氏染色基本就不會出現問題啦！