免疫組化染色之抗原的高壓修復法

免疫組織化學染色是一項廣泛應用于腫瘤病理診斷和神經解剖學的技術，一些生物公司提供的免疫組化染色服務可以把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結合起來，借助顯微鏡的顯像和放大作用，在組織、細胞甚至亞細胞水平檢測各種抗原物質。免疫組化染色方法具有操作簡單、靈敏度高、特異性強等優點，在病理診斷和病理研究領域都起著十分重要的作用。免疫組化染色質量受到多方面因素的影響，抗原修復是其影響因素之一，常見的抗原修復技術方法有高壓修復法和微波加熱修復法。

在染色過程中，用甲醛固定后，在石蠟包埋過程中會使抗原性物質或由于形成醛、羧甲基等原因而被封閉了部分抗原決定簇，或由于甲醛固定和石蠟包埋后部分抗原決定簇與核酸或其他蛋白發生交聯，形成網絡。固定液中的醛基在使蛋白質變性的同時，自身也會交聯形成網絡結構，使組織抗原決定簇封閉，從而影響免疫組織化學結果。為解決這些問題就需要做抗原修復。而抗原修復技術的應用，大大提高了免疫組化的染色效果。正確應用抗原修復技術在免疫組化染色中具有重要的作用。遠慕生物提供免疫組化染色服務。

1、高壓抗原修復法

檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復法是一種常見的高壓修復法，適合于大量中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復，其效果優于微波修復法和直接煮沸修復法，使得免疫組化結果更加可靠。儀器設備為市售不銹鋼家用壓力鍋，大小尺寸可根據需要而定(內徑18cm為好)；1000-1500W電爐一臺；不銹鋼或耐高溫塑料切片架。所需試劑為0.01M檸檬酸型緩沖液，pH=6.0±0.14.

操作步驟：

（1）常規組織切片經二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，浸泡于蒸餾水中待用。

（2）取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液(800-1500ml)于壓力鍋中，大火加熱直至沸騰；將脫蠟水化后的組織切片置于不銹鋼或耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中。蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續加熱至噴汽，從噴汽開始計時，1-2分鐘后，壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫(稍冷后，可在自來水籠頭下加速冷卻)，取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS(pH=7.2-7.4)沖洗兩次，每次3分鐘(2×3')。

(3)按有關試劑盒的操作步驟執行。

注意事項：

(1)加熱時間長短的控制很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開火源的總時間控制在5-8分鐘為好，時間過長可能會使染色背景加深。

(2)必須使用不銹鋼或耐高溫塑料切片架，不能使用銅架，以防緩沖液pH值增高而導致掉片。(3)高壓鍋離開火源后必須等緩沖液冷切后，才能把切片取出。

(4)為防止組織脫落，玻片必須經清潔處理后，涂覆Poly-L-Lysine。

(5)緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復使用。

2、高壓修復和微波加熱修復之比較

研究者研究了不同抗原修復方法對食管癌中免疫組化染色結果的影響。方法是選取Ki67、IL17、CD4和CD8四種分別定位于細胞核、細胞漿與細胞膜的不同抗原做為免疫組化染色的標記，在食管癌連續切片上應用高壓抗原修復和微波抗原修復進行比較分析。結果發現抗原高壓修復的染色效果要優于微波修復。一方面，CD4抗原高壓修復染色的陽性率要高于微波修復染色的陽性率；另一方面，CD8、Ki-67和IL-17高壓修復染色的陽性率與微波修復染色的陽性率無顯著性差異。因此在組織不易脫片的情況下，優先考慮使用抗原高壓修復；在微波修復與高壓修復染色陽性率沒有顯著性差異的情況下，應該盡可能選擇微波修復這種較柔和的方法以避免組織脫片。

抗原修復影響著免疫組化的染色質量，不同抗原修復方法影響著實驗結果的表達，目前高壓加熱法是較為廣泛的一種方法，此法不但可修復變性的抗原，同時還可使組織通透性提高，從而獲得良好的染色效果，但是在操作過程中應特別注意抗原修復液、加熱的溫度和修復時間的選擇。在實際工作中，并非所有的抗原都要進行抗原修復，抗原性保存良好或基本保存者不需要修復，同時應根據抗原種類予以選擇修復方法，必要時可多種復原方法同時使用，以其獲得更理想的結果。