乙醇固定樣品DNA抽提和直接PCR實驗

　　實驗概要

　　本實驗從乙醇浸泡的魚苗中提取DNA，并利用直接PCR進行了鑒定。

　　實驗原理

　　在實際的研究工作中，野外取樣的地點一旦較為偏遠，受條件的限制，很難保證得到的樣品活體或能夠快速冷凍；另外，對一些稀有物種和瀕危種，鮮活樣品的采集十分困難，一般為了解決這些問題，常采用乙醇和甲醛固定的方法來處理樣品，再對樣品DNA 進行提取以及擴增。使用乙醇固定樣品具有硬化，固定，脫水作用，對組織滲透迅速，特別適合組織中核酸的保存，相比于甲醛等其它固定方法，此法更簡單，保存時間更長質量更好，也更加清潔無害。乙醇固定樣品主要應用于水產種質資源鑒定，醫院或獸醫病理樣品保存，法醫樣品保存等方面，在特定物種基因保護，生物多樣性，動物分子標記，司法鑒定等方面有廣泛的應用。

　　Omega Bio-Tek 相應試劑盒既能夠快速有效的抽提得到乙醇保存多年的樣品基因組DNA，又可以利用直接PCR 系統，快速的對乙醇保存樣品進行PCR 鑒定，為您的研究提供最有力的工具。

　　實驗材料

　　乙醇浸泡的魚苗

　　實驗步驟

　　1. E.Z.N.A. Tissue Direct PCR kit

　　1) 分別取45ul AT1 和5ul AT2 到0.2ml PCR 管中，混合均勻。對于有較多樣品需要操作的，可以先將AT1 和AT2 用量計算好，混合均勻后再分裝到每一管中。

　　2) 取魚苗一條，在AT4 中浸泡約5-10min，濾紙吸干水份。

　　3) 將魚苗浸沒在上一步準備的AT1 中56℃水浴或者PCR 儀上消化10-20min，中間可以渦旋混勻一次。

　　4) 消化完后的PCR 管置于90℃水浴或者PCR 儀上5min，稍微冷卻后加入50ul AT3 渦旋混勻。

　　5) 以上裂解液就可以作為PCR 的模板直接使用，PCR 體系中建議加入5ul 左右。

　　6) 取5ul E.Z.N.A. Tissue Direct PCR kit 抽提得到的一條魚苗的DNA 作為模板，客戶提供的引物Y-30-R/F 作為引物，PCR 擴增。

　　7) PCR 擴增程序：

　　94℃ 2min；

　　94℃ 30S 52℃ 30S 72℃ 40S 33cycles；

　　72℃ 5min；

　　25℃ forever。

　　2. E.Z.N.A.? MicroElute? Genomic DNA Kit

　　1) 稱量10mg 組織，加入200ul Buffer TL；

　　2) 加20ul OB，55℃孵化至wan全降解；

　　3) 13,000xg 離心2min，轉移上清至新管；

　　4) 加220ul Buffer BL 渦旋混勻，70℃孵化10min；

　　5) 加220ul 無水乙醇，最大速度渦旋15s；

　　6) 將混合液過柱吸附，13,000xg 離心30-60s，棄濾液；

　　7) 加500ul Buffer HB，離心；

　　8) 700ul DNAWash Buffer（加乙醇）；

　　9) 13,000xg 離心2min，干燥柱子；

　　10) 加25ul 70℃預熱的Elution Buffer 洗脫。