影響免疫組化的因素及對策

一）免疫組化染色假陽性及其對策

1、消除內源酶的影響在涉及免疫過氧化酶的各種染色中，均用過氧化物酶來標記抗體，酶的作用是催化底物，使顯色劑顯色，正常組織中也含有一定量的過氧化物酶，其同樣也能催化底物顯色，而影響免疫組化染色的特異性，因此在加入標記酶前應設法將其滅活，以保證染色反應的特異性。

通常情況下，去除內源酶的方法是先用3%的過氧化氫溶液作用，但在含有豐富血細胞的標本中，由于血細胞中存在大量具有活性的過氧化物酶，能與過氧化氫產生強烈的反應，產生氣泡而破壞組織結構和細胞形態。在OCT包埋的冰凍切片中，使用3%的過氧化氫化溶液亦會產生類似現象。此時可用3%的過氧化氫甲醇溶液孵育20分鐘的方法滅活內源性酶。

滅活內源酶對正確判斷含血細胞較多的標本，如骨髓、胎盤、脾等的染色結果十分重要。同樣，正常細胞也含生物素，尤以肝、脾、腎組織含量為多。在應用親和素試劑的染色中，內源性生物素易結合后繼抗體，形成親和素（或鏈親合素）-生物素復合物，導致假陽性發生。消除這種非特異性著色的方法，是在采用生物素方法染色前，對標本進行親和素處理，使其結合位點飽和。

2、抗體導致的非特異性著色高純度、高效價的抗體是免疫組化染色的關鍵。出現下列情況時，可能發生非特異性著色。

（1）因抗原不純而導致制備的抗體不純，常見于多克隆抗體?？捎糜H和層析的方法除去非特異性抗體或應用高純度的抗原制備抗體，采用單克隆抗體能避免非特異著色。

（2）標本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇，解決的方法只有采用針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體。

3、消除非特異性背景著色

非特異性著色最常見的情況是蛋白質（抗體）吸附到組織切片中高度荷電的膠原及結締組織成分上，防止非特異性背景著色的方法之一是在滴加一抗前在標本上加一種無關的蛋白質溶液，封閉荷電點不給一抗留有吸附余地，以保證一抗不會吸附到膠原纖維及結締組織成分上。最chang用的無關蛋白質溶液是所用二抗的同種動物非免疫血清。用產生二抗的同種動物血清，是為了避免二抗與預先加入的蛋白質結合引起假陽性染色。

用來阻斷非特異性結合的血清不能有任何溶血現象。紅細胞破裂會使其中的過氧化酶與底物作用，產生非抗原特異性的陽性著色。多克隆抗體因其成分復雜，更易造成背景染色。稀釋液采用含1%BASpH7.4的PBS,同時在洗液中加入0.05%的吐溫20（Tween20）有助于消除背景染色。

4、消除病理性色素的影響

當所檢動物由于出血等原因造成吞噬含鐵血黃素細胞增多時，為防止其與DAB顯色呈現的黃褐色發生混淆，最好選用AEC顯色劑。組織固定時間過長時，切片中容易產生福爾馬林色素顆粒，影響結果觀察，取材時應充分用流水沖洗，以消除影響。

5、切片制作不當引起的非特異性著色在嚴重變性、壞死及炎性病灶處，在膠原纖維和結締組織部位，在切片裱貼不平、折皺處以及組織邊緣部位常會出現非特異性著色。其中有的是因組織荷電狀態改變而吸附抗體；有的機理不明；有的可能與組織邊緣或皺折深部的槽形構型有關，解決的辦法是在滴加一抗前，以二抗動物的正常血清（5%~10%）封閉、飽和電荷吸附位點和改善取材與制片技術。

6、清洗不充分而造成的非特異性著色應嚴格操作規程。緩沖液中含一定量的鹽，其有利于減低背景著色，通常使用0.05mlo/LPBS,溶液內加入吐溫20,效果更佳。特殊標記時，試劑公司一般都提供緩沖液的配方。另外，在清洗后至加入下一步試劑前，不能干片，干片的部位會出現非特異著色。

7、DBA顯色產生的某些背景顏色使用濃縮型DAB試劑盒時，請嚴格按照說明書標明的滴加順序操作，注意校正蒸鎦水的pH值，以確保實驗結果的正確性。粉劑DBA溶解時，常有一些不溶性顆粒，這些顆粒須經過濾除去。否則可能沉積于切片組織上，產生斑點狀著色。另外，DAB保存不妥產生氧化物亦可沉積于切片上，因此需將DAB保存于避光干燥處，現用現配，臨用前加H2O2.

（二）免疫組化染色的假陰性及其對策

通?？梢驑吮究乖４?，試劑質量及染色操作等因素引起假陰性。

1、組織處理不當固定不及時或固定時間過長常導致抗原丟失。浸蠟溫度過高，時間過長將破壞抗原的抗原性。應改善技術條件，重新取材。

2、抗原修復由于目前所進行的常規石蠟切片標本均用甲醛固定，所形成的醛健、羧甲鍵等封閉了部分抗原決定簇，或由于蛋白之間發交聯而使抗原決定簇隱蔽，因此在染色時，有些抗原需要先進行抗原修復或暴露。至于哪種抗原需要進行修復，需在建立染色程序時經實驗確定?？乖迯头譃榛瘜W方法和物理/化學方法。

（1）化學方法：主要是通過一些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等。需根據需要使用。（2）物理/化學方法：主要有以下幾種

①單純加熱方法：將片子放入裝有檸檬酸鹽緩沖液的容器中，加熱至沸騰，并持續10~15分鐘，此方法操作簡單、經濟，適用于所有實驗室，但對封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。②高壓加熱方法：將片子放入裝有檸檬酸鹽緩沖液的高壓鍋中，加熱至噴氣，并持續1~2分鐘。

③微波方法：將片子放入裝有檸檬酸鹽緩沖液的容器中，置微波爐加熱至95℃以上，并持續10~15分鐘，室溫20~30分鐘自然晾涼，使蛋白復性。此方法不僅利用熱效應，且可通過微波的直接作用，打開蛋白之間的交聯鍵，將已被封閉的抗原決定簇暴露和修復。

3、一抗的選用、稀釋度及孵育時間第一抗體是免疫組化染色中最重要的試劑。應用何種一抗，應根據具體目的和要求決定。臨床病原診斷，要求較高的敏感性和較廣的識別譜時，可選用多克隆抗體或幾株混合的單克隆抗體，來避免抗體反應譜過窄造成的假陰性。某些研究工作需要檢測單一抗原決定簇的存在，此時必須選用單克隆抗體。一抗的參考稀釋度常由“方格滴定"和相關檢測結果推測得出，但因實驗條件不同，對抗原活性的影響不同，最佳稀釋度仍需經過摸索。任何一個抗體，其工作稀釋度取決于如下因素：

（1）抗體的滴度即特異性抗體濃度；

（2）抗體的純度，即抗體中雜蛋白的濃度。雜蛋白較高時，需要較高的稀釋度；

（3）孵育的時間，時間越長，所用的抗體稀釋倍數越高；

（4）組織中抗原含量對抗體的應用濃度有不同的要求。在免疫反應中，過多的抗體將導致陰性結果，這種現象類似于凝集反應中的前帶現象。因此需用“方格滴定"的方法找出適當的稀釋度，

并得到最大強度的抗原染色和最di的背景著色。一般認為，某一稀釋度下特異性染色較強且無背景著色，是較理想的稀釋度，加長孵育時間可有效地降低所用抗體的濃度，有利于提高染色質量，節省抗體，可用37℃0.5h或4℃過夜的方法。只要控制好溫度、抗體稀釋度和孵育時間，一般都能得到理想的染色效果。

4、選擇適宜的二抗二抗應用中常出現的總是是抗體本身與一抗不匹配，如抗兔的二抗，匹配鼠來源的一抗；或以抗鼠的二抗匹配兔來源的一抗，都會出現假陰性結果。

5、試劑造成的影響酶的活性降低，緩沖液內加有疊氮鈉抑制了酶活性，底物中所加H2O2量少或失效，操作中漏加了某種試劑等，都會造成假陰性結果。如陽性對照不成立，則需認真檢查操作程序，查找可能的原因。