凝膠遷移實驗（EMSA）看這篇就夠了！

概念

EMSA 稱凝聚阻滯實驗或凝膠電泳遷移率檢測， 是一種用于研究轉錄因子和其相關的 DNA 結合序列相互作用的技術，能對各類轉錄因子的 DNA 結合活性進行定性和半定量分析，是一項研究細胞信號轉導通路的關鍵實驗技術。這一技術最初用于研究DNA結合蛋白，目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

原理

EMSA 主要基于蛋白-探針復合物在在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。根據實驗設計特異性和非特異性探針，當核酸探針與樣本蛋白混合孵育時，樣本中可以與核酸探針結合的蛋白質與探針形成蛋白-探針復合物；這種復合物由于分子量大，在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移較慢，而沒有結合蛋白的探針則較快；孵育的樣本在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜后，蛋白-探針復合物會在膜靠前的位置形成一條帶，說明有蛋白與目標探針有互作。

分類

同位素標記探針

特點：特異性強、敏感性高達到10-18mol水平，對操作人員身體有害

非同位素標記探針------應用最為廣泛

特點：無需放射顯影，采用生物發光或化學發光原理。靈敏度高，信號強

EMSA的特異性

常用實驗技術中免疫組化、免疫印跡 ( WesternBlotting) 和 EMSA 均可用于轉錄因子檢測，但三者的側重點各有不同。免疫組化或免疫熒光技術可以較準確的反應轉錄因子的表達部位和表達細胞， Western Blotting 可以精確定量轉錄因子。但并非所有轉錄因子均可以與 DNA 結合以刺激基因轉錄，唯有 EMSA 技術可以反映轉錄因子是否具有 DNA 結合活性，故 EMSA 是證明細胞信號轉導通路最終效應的必要實驗技術。

實驗步驟（步驟來源與網絡僅供參考）

探針的標記

①:探針標記的反應體系(1.75pmol/μl) 2μl

T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1μl

Nuclease-Free Water 5μl

[γ-32P]ATP (3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1μl

T4 Polynucleotide Kinase (5-10u/μl) 1μl

總體積 10μl

②:使用水浴或PCR儀37℃反應10min.

③:加一定體積的終止液、混勻、終止探針標記.

④:加入一定體積的TE、混勻.

探針的純化(視情況定）

對于100μl標記好的探針，加入一定量的醋酸銨和無水乙醇

在-70℃沉淀1h或在-20℃沉淀過夜

在4℃12000g-16000g 離心30min 棄上清

在4℃12000g-16000g 離心1min、吸去殘余液體

加入一定體積的 TE ,使沉淀溶解

探針使用時間一般不超過3天，保存在-20℃

實驗中常見的問題：

1、為什么看不到遷移帶？

1）蛋白樣本提取質量不高，蛋白降解或者提取量不足。

2）樣本中沒有可以與探針結合的蛋白。

3）探針與蛋白無特異性的相互作用。

4）轉膜效率低，蛋白或者探針未轉移到膜上。

5）曝光或者成像時間過短。

6) 在 Super-Shift EMSA 測定中看不到 Super-Shift DNA/蛋白復合物帶還可能有以下原因：

a. 抗體沒有工作。不是所有的抗體都可以用于 Super-Shift EMSA，只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應的抗體才能夠用于 Super-Shift EMSA。

b. 測定的活化的 DNA/蛋白復合物中沒有希望檢測的構成成分存在。此時既看不到 Super-Shift 的帶，也看不到 DNA/蛋白復合物的量的減少。

c. 使用的抗體過度稀釋。一般 10～20 ul 的反應液需要使用 0.5～1 ul 原倍的抗體。

d. 多抗與 DNA/蛋白復合物形成大的聚集物而不進膠。在這種情況下，雖然看不到 Super-Shift 的帶，但應當可以看到 DAN/蛋白復合物的電泳帶明顯減少。

2、為什么實驗背景高？

1）曝光或者成像時間過長。

2）封閉時間不足或者效率不高。

3）洗滌效果不佳。

4）實驗過程中膜沒有一直處于濕潤狀態。

3、EMSA 測定需要多少量的蛋白與標記的探針？

對每一個特定的結合蛋白和探針，所用的純化蛋白，部分純化蛋白，粗制核抽提液需作優化：一般所用純化蛋白的量在 20～2 000 ug 間，用粗制核抽提液，需要 2～10 ug 蛋白形成特異的復合物。部分純化蛋白與粗制核抽提液應保存在 -80 ℃、探針應保存在 -20 ℃ 以防止降解。

無論探針或是結合蛋白都應避免多次凍融。

4、用什么凝膠條件將蛋白質/探針復合物和游離的探針分離開？

將結合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結合，蛋白/探針復合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為 6%，在特定條件下可用高或低的濃度。也可將 TGE 緩沖液（12.5 mM Tris，pH8.3，95 mM 甘氨酸，0.5 mM EDTA）用于不穩定的蛋白/DNA 復合物。在 4 ℃ 進行結合和電泳實驗以阻止不穩定復合物和探針的解離。

5、Poly(dI:dC)，非特異性競爭 DNA，特異性競爭 DNA 在 EMSA 測定中的作用？

Poly(dI:dC) 由肌苷和胞嘧啶組成。在 EMSA 反應中加入 poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中轉錄調節因子與標記探針的非特異結合。結合溶液中的 poly(dI:dC) 的用量需在正式實驗前進行優化，一般用量大約在 0.05 mg/ml 左右。當用純化的蛋白作凝膠遷移反應時，不必一定加入 poly(dI:dC)，如加入，則普通反應中所用終濃度不超過 50～100 ug。對核抽提液，每 2～3 ug 核抽提液用 1 ug poly(dI:dC)。