標準曲線的正確繪制方法

分析檢測中繪制標準曲線目的是可以根據標準曲線查出待測物質的含量，所以標曲的制定是實驗室工作中bi不可少的工作。做標準曲線真的那么簡單？你所做的標曲真的做好了嗎?導致標準曲線彎曲的原因是啥？RSD值、線性相關系數和線性方程如何？線性好與不好分別由于哪些原因造成的？是儀器、標液，還是配制的問題？接下來遠慕生物帶你來找找原因！

前期測定時注意：

1、儀器校驗好。

2、移取液體體積要精確，保證迅速準確，盡可能用一根移液管；為減小人為誤差，同一種液體要一個人操作。

3、保證標準品的純度，所用標準品最好是新打開的，純度較高的固體或溶液，防止污染。

4、容器要保證潔凈。

5、根據標準品理化性質注意加樣的先后順序。

6、如果要測OD值，應保證測前各管液體充分混勻。

7、若還是有某個點誤差較大，應舍棄。

另外：

1.樣品的濃度等指標是根據標準曲線計算出來的，所以首先要把做標準曲線看作是比做正式實驗還要重要的一件事，否則后面的實驗結果無從談起。

2、設置標準曲線樣品的標準濃度范圍要有一個比較大的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測實驗樣品的濃度，即樣品的濃度要在標準曲線濃度范圍之內，包括上限和下限。而對于呈s型的標準曲線，盡量要使實驗樣品的濃度在中間坡度最陡段，即曲線幾乎成直線的范圍內。

3、最好采用倍比稀釋法配制標準曲線中的標準樣品濃度，這樣就能夠保證標準樣品的濃度不會出現較大的偏離。

4、檢測標準樣品時，應按濃度遞增順序進行，以減少高濃度對低濃度的影響，提高準確性。

5、標準曲線的樣品數一般為7個點，但至少要保證有5個點。

6、做出的標準曲線相關系數因實驗要求不同而有所變動，但一般來說，相關系數r至少要大于0.98，對于有些實驗，至少要0.99甚至是0.999。

分光光度法繪制標準曲線所遇問題？

1、單色光純度不夠

問題：標準曲線上端向下彎曲。

措施：光度法中要求在最大吸收峰處測定吸光度，光度計的有效譜帶寬度越窄越好，有利于獲得純度高的單色光。

2.比色皿的厚度或光學性能不一致

如果裝試劑空白液的比色皿較其它比色皿薄或對光的吸收和反射少一些，則曲線的延線與縱坐標相交；反之，與橫坐標相交。

3.顯色反應和反應條件的問題

當顯色反應的靈敏度不高時，被測物低于某一濃度就不能顯色，當濃度不同時，溶液對光的吸收、散射的程度不同，低濃度段往往彎曲，加上濃度高時部分膠體顆粒的聚沉，致使測定的吸光度降低，曲線上端向下彎曲。

4.操作上的原因

問題：褪色反應，顯色溶液的顏色不穩定、易褪色，若比色時間超過了穩定時間，標準系列中高濃度溶液顏色減褪，致使曲線上端向下彎曲。

措施：控制好顯色劑的加入時間，可以每加3份，停3～3min，再加上3份，依次進行，以使每支比色管的顯色時間相近。

5、干擾物質的影響

標準曲線繪制完畢了，該如何檢驗？

標準曲線的檢驗是實際操作中最大的難點，也是工作中誤區和爭議最多的話題了！

先來了解下最重要的三大檢驗項目：

1.精密度檢驗

標準曲線的精密度檢驗：精密度檢驗就是看試驗點距離擬合的直線的距離有無異常，所以也稱線性檢驗（擬合檢驗），需用F檢驗，P<0.05作為線性檢驗合格的標準。

2.截距檢驗

3.斜率檢驗

標準曲線的截距檢驗和斜率檢驗分別考察Y=a+bX中a和b與0的統計學差異，a與0有差別說明有試劑空白或系統誤差，而b若與0沒差別說明儀器的靈敏度根本達不到分析要求。

標準曲線的檢驗應該是線性檢驗結合失擬檢驗，以及殘差的正態性檢驗結合才是統計學上比較完備的。

標準曲線常見問題匯總

問題一：標準曲線需要人為的增加（0,0）點嗎？

答：不能。通常的標準系列多是配制0,1,2,3mg/L系列這樣的說法，沒做實驗人為添加（0,0）很不妥，因為很多時候0管進入儀器可能也有響應值，這也是我們考察試劑空白的一個重要步驟。這個0管在某些時候非常重要，如，全血鉛測定，我們采用牛血清來基體匹配標準系列，如果此時你用酸做空白或沒做實驗人為添加（0,0），那你就很難做好標準曲線，所以，標準曲線的0管也是做好標準曲線的重要考慮點。

問題二：標準曲線需要減掉試劑空白來做嗎？

答：不需要。儀器測出來標準系列的響應值可以減掉試劑空白或減掉0管的響應值來做，工作中我們也常用0管來做儀器調零。其實沒有必要那么麻煩，即使空白或0管有響應值，在構建標準曲線時，我們已經認為該響應值就是0濃度，也就是扣除了這個空白的。

問題三：什么時候用Y=bx和二次曲線呢？

答：標準曲線我們通常采用的是Y=a+bX，曲線擬合完必須要做統計檢驗且要做統計完備的線性檢驗和失擬檢驗，然后再做a與0的差別檢驗，如果a與0的統計學上無差異，你就可以考慮用Y=bX的擬合曲線，擬合出來后同樣做線性檢驗和失擬檢驗，如果線性檢驗合格（P<0.05）且失擬檢驗合格（p>0.05）此時你就可以采用Y=bX。二次曲線的采用同樣是這樣的道理，如果你Y=a+bX時擬合不合格，你就考慮用Y=a+bX+cX2，同樣做失擬檢驗，考察擬合的符合情況。如果Y=a+bX 和Y=a+bX+cX2都滿足擬合檢驗和失擬檢驗合格，則采用Y=a+bX形式，這樣符合統計學上參數最少的統計簡潔性原則。

問題四：標準曲線去查含量時是先減空白信號算樣品含量還是先算出空白含量相減呢？

答：工作中我們常要減掉空白得到樣品含量，現有國家標準方法有的推薦先算出空白含量，用樣品含量相減，也有推薦先用樣品信號減空白信號然后去標準曲線推算含量。而且這兩種算法常常差距很大。其實這種差距往往是低含量水平時才出現，在低含量水平通過標準曲線推算含量時，本身不確定度就很大。這兩種方法都可以。個人推薦先用樣品信號減空白信號然后去標準曲線推算含量，因為這樣出來的含量不確定度要小一些，而先算出空白含量再相減就增加了1次標準曲線推算含量時的不確定度，因為好的測量永遠是不確定度小的測量。

結語

要想繪制出合格的標準曲線、使用好標準曲線，真心不易，必須將以上各個方面的條件都考慮進去，即對標準曲線的繪制也實行質量控制，只有這樣, 才能得出理想的標準曲線。

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