微生物常用染色法及染色制備介紹

微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學因素的作用而進行的。物理因素如細胞及細胞物質對染料的毛細現象、滲透、吸附作用等?；瘜W因素則是根據細胞物質和染料的不同性質而發生地各種化學反應。酸性物質對于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩固；同樣，堿性物質對酸性染料較易于吸附。如酸性物質細胞核對于堿性染料就有化學親和力，易于吸附。但是，要使酸性物質染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以改變（如改變pH值），才利于吸附作用的發生。相反，堿性物質（如細胞質）通常僅能染上酸性染料，若把它們變為適宜的物理形式，也同樣能與堿性染料發生吸附作用。

常用染色法

單染色法

只用一種染料染色。由于大多數細菌胞漿內含有酸性物質，可與堿性染料結合，故常用呂氏美藍、結晶紫和稀釋石碳酸復紅等染液。此法可觀察細菌的大小、形態與排列，不能顯示細菌的結構與染色特性。

2.復染色法

用兩種或兩種以上不同染料可將細菌染成不同的顏色，除可觀察細菌的大小、形態與排列外，還反應出細菌染色特性，具有鑒別細菌種類的價值。常用的有革蘭染色法和抗酸染色法。

(1)革蘭染色：①細菌涂片經火焰固定，加結晶紫染液染1min，清水沖去染液。②加碘液媒染 1min，水洗，甩干。③用95%乙醇脫色，輕輕搖動約30s，至無紫色洗落為止，水洗，甩干。④加稀釋石碳酸復紅或沙黃染液數滴進行復染，約30s，水洗。⑤干后顯微鏡下鏡檢觀察結果，革蘭陽性菌染成紫色，革蘭陰性菌為紅色。

(2)抗酸染色：萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法：

①細菌涂片經火焰固定，加石炭酸復紅溶液，徐徐加熱至有蒸氣出現，切不可沸騰。染液因蒸發減少時，應隨時補充，防止染液蒸干。持續染5min(奴卡菌需要加長時間)，水洗，甩干。

②滴加3%鹽酸乙醇脫色，不時搖動玻片至無紅色脫落為止，水洗，甩干。

③加呂氏美藍復染液數滴復染1min，水洗。

④干后顯微鏡下鏡檢觀察結果，抗酸桿菌染成紅色，非抗酸桿菌為藍色。

金胺O-羅丹明B染色法：①細菌涂片固定后加第1液30——90s。②棄去第1液后加第2液染15min。③用第3液脫色1——2min，水洗。④滴加第4液染30s，水洗，

⑤干后置熒光顯微鏡下鏡檢觀察結果 在淡藍色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其它細菌和細胞呈藍色。

3.特殊染色法

(1)鞭毛染色(改良Ryu法)：

①玻片的處理 將新載玻片浸泡在95%乙醇中。臨用時取出，以干凈紗布擦干。

②在玻片上滴蒸餾水1滴。

③挑取培養物少許，輕觸蒸餾水滴頂部，僅允許極少量細菌進入水滴，不可攪動，以免鞭毛脫落。④置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1——2 min輕輕水洗。

⑤干后顯微鏡鏡檢觀察結果 鞭毛和菌體呈紫色。

(2)異染顆粒染色(阿爾培托法)：

①細菌涂片經火焰固定，加甲液染色3——5min。水洗。

②滴加乙液，染1min。水洗。

③干后顯微鏡鏡檢觀察結果 菌體呈綠色，異染顆粒呈藍黑色,用于白喉棒狀桿菌染色。

(3)莢膜染色：

①奧爾特莢膜染色法：將已固定的細菌涂片滴加3%沙黃染液，用火焰加溫染色，持續3min，冷卻后水洗，待干鏡檢。結果：菌體呈褐色，莢膜呈黃色，此法主要用于碳疽芽胞桿菌。

②Hiss氏硫酸銅法：染液：第一液為結晶紫乙醇飽和液5ml加蒸餾水95ml 的混合液;第二液為20%硫酸銅水溶液。方法：細菌涂片自然干燥，乙醇固定。滴加第一液，微加熱染1min。再用第二液將涂片上的染液洗去，勿再水洗，傾去硫酸銅液，以吸水紙吸干鏡檢。結果：菌體及背景呈紫色，莢膜呈鮮藍色或不著色。

(4)芽胞染色：

染液：第一液為萋-納氏石炭酸復紅液，第二液為95%乙醇，第三液為堿性美藍液。

方法：將已固定的細菌涂片滴加第一液，微加熱染5min，冷卻后水洗。用第二液脫色2min，水洗。加第三液復染1min，水洗，待干鏡檢。結果：菌體呈藍色，芽胞呈紅色。

4.負染色法

背景著色而菌體本身不著色的染色為負染色法。最常見的是墨汁負染色法，用來觀察真菌及細菌莢膜等。在標本涂片處滴加染液，混合后加上蓋玻片(勿產生氣泡)，輕壓。在低倍鏡下尋找有莢膜的菌細胞，轉高倍鏡或油鏡確認，如新型隱球菌可見寬厚透亮的莢膜，背景為黑色。

5.熒光染色法

經熒光素染色的細菌，或熒光素標記的熒光抗體與相應抗原的細菌、病毒結合形成的復合物，在熒光顯微鏡下發出熒光。

細菌染色的一般程序

細菌染色的一般程序是：涂片(干燥)—固定—染色(媒染)—(脫色)—(復染)。

涂片制備

血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液體培養物，直接在載玻片上作薄膜涂片;尸檢或感染動物組織，病變局部涂抹采樣的棉拭子直接涂片。固體培養基上的菌落或菌苔的制片，先用接種環取一環生理鹽水置載玻片中央，再用無菌接種環取少量的培養物在生理鹽水中磨勻，涂布成1cm2大小的涂面，置室溫下自然干燥或遠火慢慢烘干。

2.固定

目的是殺死細菌，凝固細菌蛋白及結構，便于染色;促使細菌粘附在載玻片上，避免在水洗過程中被水沖掉;改變細菌對染料的通透性，有利于菌細胞內結構的染色。通常用火焰加熱固定，將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。

3.染色

根據檢驗目的不同，選擇不同的染色方法進行染色。染色時滴加染液，以復蓋標本為度。

4.媒染

凡能增強染料和被染物的親和力，使染料固定于被染物及能引起細胞膜通透性改變的物質，稱媒染劑。常用的有明礬、鞣酸、金屬鹽和碘等，也有用加熱法促進著色。媒染劑可用于初染與復染之間，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。

5.脫色

凡能使已著色的被染物脫去顏色的化學試劑稱為脫色劑。常用乙醇、丙酮等作為脫色劑。脫色劑可以查出細菌與染料結合的穩定程度，作為鑒別染色之用。

6.復染

已脫色處理的細菌或其結構常以復染液作復染以便于觀察。復染液與初染液的顏色不同而成一鮮明對比。復染不宜太強，以免掩蓋初染的顏色。

主要用于厭養菌動力的檢查。通常選用60——70mm長。0.5——1.0mm孔徑的毛細管虹吸厭養菌懸液后，用火焰將毛細管兩端熔封。并用塑膠紙將毛細管固定在載玻片上，置高倍鏡下暗視野觀察。