PCR反應的核心成份——DNA聚合酶的選擇

PCR即聚合酶鏈式反應，對于常年狂奔在實驗室的實驗人來說并不陌生。那么，對于PCR反應的核心成份，DNA聚合酶，你選對了嗎？

常見的 DNA 聚合酶如 Taq、Phanta、Pfu、KOD、Primerstar、Klenow、Bst、Phi29 等等。根據耐熱性來分可分為耐熱酶和常溫酶。耐熱聚合酶如 Taq、Pfu、KOD、Primerstar 等，常溫聚合酶包括 Klenow、Bst、Phi29 等。根據保真度來分，高保真聚合酶 Pfu、KOD、Phanta 等，普通聚合酶 Taq 等。

DNA聚合酶的功能

1）通過核苷酸聚合反應，使DNA鏈沿5’→3’方向延長（DNA聚合酶活性）[1]

2）催化由3’端水解DNA鏈（3’→ 5’核酸外切酶活性，用于切除錯配的堿基）[1]

3）催化由5’端水解DNA鏈（5’→ 3’核酸外切酶活性，用于切除引物）[1]

4）催化由3’端使DNA鏈發生焦磷酸解

5）催化無機焦磷酸鹽與脫氧核糖核苷酸三磷酸之間的焦磷酸基的交換

面對如此之多的選擇，大多數剛進實驗室的新生們默默表示，選擇恐懼癥犯了……那么，解決的方法是，根據實驗目的選擇合適的 DNA 聚合酶。比如：常規的 PCR 擴增和菌液鑒定，長度小于 5kb 的片段，保真度要求不高，使用 Taq 酶擴增即可。選用 Mix 的形式，混樣更加簡單，操作更加便捷。如果混樣泡沫多，想滅掉泡沫的話，推薦大家使用 Green Taq Mix。想要獲得較高的產量，可以選擇 Taq Plus DNA 聚合酶，相對于 Taq 酶擴增性能更強。

1. 選擇熱啟動酶降低非特異性擴增

在使用 Taq 酶進行擴增時，有時會出現非特異性擴增，可能的原因可以從模板、引物、體系、程序中一一排查。如模板是否被污染，引物特異性如何，Mg2+濃度偏高等等，其中一個不可忽視的原因是 DNA 聚合酶的種類是否合適。如果排查了其它原因仍舊有非特異性產物，可以選擇熱啟動酶重新實驗，即可有效減少或消除體系中其它產物的積累。常用的熱啟動酶分為兩類：一類是化學法修飾的熱啟動酶，如 Ace Taq ，預變性 95℃5 - 10 min 即可釋放酶活；一類是抗體法修飾的熱啟動酶，如 Champagne Taq ，預變性 95℃30s 即可釋放酶活。使用時注意預變性時間，方能獲得滿意的擴增效果。

2. 選擇 Lamp 擴增長片段

大于 5Kb 的長片段又該如何擴增呢？如果實驗對保真度的需求不高，那么就可以使用 LAmp DNA 聚合酶。其保真度是 Taq 酶的 6 倍，可擴增超過 20Kb 的基因組、cDNA 片段，對于低拷貝、低純度、以及不同 GC 含量的模板都具有很高的成功率。

3. 選擇高保真酶快速高效擴增

如果實驗對保真度要求較高，在選擇 DNA 聚合酶的時候就需要使用高保真酶，如 Pfu、KOD、Primerstar、Phanta 等。前三者都屬于第一代高保真酶，已在市場中廣泛使用。諾唯贊科研團隊的大力改造生產的 Phanta 系列的高保真酶，保真度達到了 Taq 酶的 50 倍，擴增性能、擴增長度、產量、模板適應性都顯著提升。Phanta Max 保真度是 Taq 酶的 53 倍，Pfu 的 6 倍，對于質粒等簡單模板有效擴增長度可達 40kb，cDNA 有效擴增長度可達 10kb，基因組有效擴增長度可達 20kb，適合于各種 GC 含量的擴增，可用于多種樣本的直接 PCR 如植物葉片、全血等。且擴增僅需 30s/kb，甚至于 2kb/s。如此卓zhuo越，愛不釋手了吧？

4. 選擇直接擴增試劑盒對粗品擴增

xxx生產的各種直擴試劑盒，直接對粗品進行擴增，大大減少了實驗的工作周期。如小鼠基因型鑒定可以直接使用 One Step Mouse Genotyping Kit，全血擴增可以直接使用 Blood Direct PCR Kit V2。